L'exploration des aptitudes régénératives du greffon chez Pinctada margaritifera (huître perlière de Polynésie française) s'inscrit dans le domaine d'exploration et d'extension des connaissances à destination du génie cellulaire. Le programme de recherche OCEANIS porte sur la caractérisation de cellules multipotentes en vue d'une production assistée "d'explants équivalents".

C.P : Mais quel est l'intérêt de ces recherches ?

Ph. R. « La découverte de l'aptitude régénérative des cellules souches humaines date sensiblement des années 1950. Elle a généré rapidement de vastes espoirs sur un possible "génie cellulaire", lesquels se sont rapidement confirmés dans plusieurs domaines thérapeutiques. La production de derme équivalent, en 1979, appliquée à la greffe de peau pour les grands brûlés ou irradiés ; le prélèvement de cellules myéloïdes, dans les années 1980, à destination des greffes de moelle osseuse pour le traitement des leucémies, sont des applications aujourd'hui maîtrisées. Plus récemment l'implantation de cellules multipotentes, vers une différenciation en neurones, en vue du traitement de la maladie de Parkinson ou d'Alzheimer, marque le potentiel remarquable de cette voie de recherche. Dans ce domaine, le Laboratoire de Biologie des cellules souches du CNRS de Villejuif ou encore les équipes de François Jacob, Nicole Le Douarin et Shahragim Tajbakhsh de L'Institut PASTEUR, ont acquis désormais une renommée internationale.

C'est sur l'observation de ce principe d'aptitude régénérative, que Kichimatsu Mikimoto, sans en connaître les modalités physiologiques, inventa le procédé de culture par greffe, selon la technique d'enveloppement du greffon. Si l'on peut souligner la formidable capacité d'observation et les qualités intuitives exceptionnelles de cet inventeur, on peut amèrement déplorer que les moyens d'exploitation soient restés aussi frustes depuis un siècle.

La compréhension des mécanismes cellulaires et les progrès considérables réalisés dans l'identification de l'expression génétique sont partiellement transférables sur l'étude du fonctionnement de cellules souches multipotentes appartenant à des invertébrés. Ces études présentent plusieurs intérêts :

  • une extension des connaissances scientifiques du modèle cellulaire des invertébrés, comparatif avec les cellules humaines
  • une application des techniques de sélection, de traitement et d'induction sur des cellules autres que humaines
  • une exploitation de procédés à des fins d'économie

Autant d'arguments cognitifs, techniques et financiers justifiant un programme de recherche associé. »

C.P : Où en sont donc les recherches appliquées à la perliculture ?

Ph. R. «Dès le fondement de nos recherches, en 2001, nous avions émis l'hypothèse que la potentialité du greffon résidait dans ses aptitudes régénératives. Au vue des recherches déjà exprimées, en biologie humaine, la proposition semblait facile. Encore fallait-il pouvoir se doter des moyens techniques et financiers pour engager un programme de recherche dont les visées seraient une rapide mise en application de procédés novateurs. Le scepticisme était grand, en particulier vers les "autorités compétentes en perliculture", qui trop occupées à gérer des situations économiques déplorables, ne pouvaient envisager des solutions techniques salvatrices.

Dans la première phase du programme de recherche fondamentale, nous avons caractérisé tous les types cellulaires composant le greffon. En 2003, nous avons identifié des massifs de cellules, circonscrits au sein du tissu conjonctifs (fibroblastes) présentant les particularités de cellules mitogènes. Des techniques de traçage immuno-chimique ont permis de détecter ces massifs néoblastiques et de suivre leur prolifération, in situ, après soumission à un stress mécanique. Nous étions les premiers à faire cette observation chez Pinctada margaritifera. En fait, nous venions de comprendre le mécanisme intime de la régénération de cellules souches multipotentes après implantation du greffon.

Dans le tissu épithélial, sur lequel sont prélevés les implants, les "cellules souches multipotentes" (mSC) sont en nombre très restreints. La numération, en microscopie sous épi-fluorescence, fait apparaître une fréquence proche de 1mSC / 7 000 cellules différenciées. Le pistage est donc extrêmement délicat. Le repérage a été rendu possible par l'usage de marqueurs moléculaires ayant une affinité spécifique pour un type précis de protéine extra-membranaire. Ils permettent ainsi d'identifier les mSC sans équivoque.

La caractérisation a été réalisée en microscopie électronique (x10 000). Elle fait apparaître une structure typique des cellules indifférenciées, présentant un rapport nucléo-plasmique proche de 1 et une ultra-structure intra-cytoplasmique peu développée (noyau clair à chromatine enchevêtrée peu différenciée, absence de nucléole, membrane nucléaire présentant de nombreux pores, faible présence d'organites cellulaires, organisation ribosomiale dense et peu structurée, liaisons inter-membranaires denses).

De plus les noyaux des mSC, peuvent être très facilement repérés, par de colorants spécifiques, en interphase, selon leur activité hétérocatalytique (transcription d'ARN) et autocatalytique (réplication de l'ADN). L'observation, in vivo, devient alors plus aisée et une localisation micro-cartographique est alors possible. Ainsi, nous avons repéré des pôles de restauration préférentielle. Concrètement ces zones sont favorables à un prélèvement optimal pour le greffoneur.

La sélection des mSC est obtenue par des techniques d'hydrolyse enzymatique des tissus épithéliaux, en milieu tamponné. Plusieurs transferts consécutifs, dans des milieux sélectifs, permettent d'obtenir un hydrolysat de la fraction matricielle, dans laquelle sont inclus les différents types cellulaires. On procède, par centrifugation différentielle, à une migration cellulaire selon le gradient de centrifugation. L'isolement est réalisé par pipetage Pasteur. Le contrôle de purification est obtenu en criblage par cytomètrie de flux. La caractérisation est effectuée sous microscopie photonique. La conservation des isolats cellulaires est entretenue sur milieu nutritif.

Le mécanisme biochimique qui conduit à la différenciation cellulaire est encore inconnu. Toutefois, le phénomène d'induction a déjà été caractérisé, pour la différenciation, vers certains types cellulaires humains (Pax3, Pax7) - Institut PASTEUR CNRS - URA 2578 Dr TAJBAKHSH Shahragim - 2006. Les méthodes et techniques d'investigation seraient transférables pour une éventuelle caractérisation des facteurs d'induction chez Pinctada margaritifera.

Il est probable, que des signaux biochimiques extra-cytoplasmiques parvenant dans la "niche cellulaire" enclenchent une transduction intra-cytoplasmique à l'origine de la différenciation. C'est ce signal, encore non identifié, qui est cependant activé lors de l'édification du sac perlier, consécutivement à une greffe classique. On peut, dès lors, supputer le (ou les) facteur(s) d'activation comme portés par la membrane de cellules différenciées (sites protéiques extra membranaires) ou solubilisés dans le milieu extra cytoplasmique. La conversion serait induite par un effet de proximité. Elle serait initiatrice du rétablissement de l'intégrité du tissu allogénique dans l'encaissant, réalisant ainsi la fonction de régénération.
Si le mécanisme d'induction demeure encore hypothétique, l'isolement de cellules mSC et leur prolifération, ex vivo, représente toutefois une étape essentielle vers la maîtrise du potentiel régénératif. »

C.P: Quel avenir pour ces biotechnologies appliquées à la perliculture ?

Ph. R. « L'isolement et le contrôle de la différenciation, de lignées isogéniques, ouvrent des perspectives, vers une production maîtrisée délaissant l'aléatoire. En exploitation de laboratoire, il devient alors possible de produire, in vitro, des "explants équivalents". Il s'agit, en fait, de greffons potentialisés obtenus à partir de la sélection, de la prolifération et de la différenciation contrôlée de mCS. La technique d'implantation de ces explants, est identique à celle pratiquée par les actuels greffeurs. Le geste technique n'est absolument pas modifié.

La seule adaptation relèvera davantage des orientations économiques des producteurs. Soit une greffe classique aux faibles coûts de production, mais aux rendements incertains ; soit une culture accompagnée présentant un coût d'assistance pour une production améliorée. Ces "procédés avancées" actionnent dans le sens d'une pratique sûre, durable et économe. C'est bien là les finalités visées par ce programme de recherche !

Ces innovations biotechnologiques pourraient conférer, à la perliculture polynésienne, une avance considérable. »

Propos recueillis par Cécile FLIPO, reporter journaliste

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